慢病毒包装二质粒系统使用方法-中文-BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心

慢病毒包装二质粒系统使用方法-中文

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一、慢病毒包装
      基本介绍：慢病毒包装系统由一个包装质粒混合物和慢病毒载体质粒组成，慢病毒质粒pLVX-Puro包含HIV的基本元件5’ LTR和3’ LTR以及一些辅助元件；pSPAX2质粒含编码HIV病毒主要蛋白的gag基因和编码病毒特异性酶的pol基因；pMD2.G质粒含有提供病毒包装需要的VSV-G基因。
      实验材料：指数生长的293T细胞；转染试剂；病毒包装质粒Mix= pLVX: pSPAX2: pMD2.G=4:3:1（以上5种生物材料我们平台均可提供）
      包装步骤：
1、细胞分盘：通过胰酶消化收集细胞，接种于培养皿（根据您实验需要选择）。置于含5% CO₂的37℃培养箱孵育8-24h，细胞贴壁后进行转染。
2、混匀核心质粒和包装质粒:取无菌1.5ml EP管，加入400μl 无血清DMEM，加入1.5μg 核心质粒和1.5μg 病毒包装质粒，及6μl lipo2000，充分混匀，静置15-20min。
3、孵育：将这400μl的混合液逐滴加入细胞培养皿中，轻轻混匀后置于含5％CO₂的37℃培养箱孵育。
4、收集病毒上清：转染后24h、48h左右收集含慢病毒的上清，分装冻存于-80℃。
5、病毒感染：将细胞平铺于35mm培养皿，12-24h后换液，最佳密度为30%－50％。加入收集的病毒上清液培养。细胞长满后传代或者检测表达。

二、包装检测
1、含有荧光标记或报告基因的病毒载体，可通过转染细胞测定其滴度。
2、不含报告基因的病毒载体，可通过试剂盒测定病毒颗粒中相关病毒蛋白的活性或含量确定其滴度。
3、通过定量PCR测定滴度。

三、注意事项
1、避免小提的质粒，其浓度和纯度一般比大提质粒的浓度低，可能会降低包装效率。
2、转染时的细胞密度在40-60%之间比较合适，当细胞出现汇合时，及时更换或添加新鲜培养基以保持细胞健康状态。
3、收集病毒上清时离心可以去除细胞碎片及少数悬浮的293T细胞，必要时可以过滤以彻底去除细胞成分的污染。
4、收集病毒时，过滤会去除细胞污染，VSV-G残留片段对细胞的毒性，但也会部分影响病毒滴度。
5、避免多次反复冻融，冻融会降低病毒侵染效率；病毒放置于4℃也会降低侵染效率。
6、VSV-G会介导病毒与细胞的融合，对细胞造成一定毒性，所以在重悬病毒沉淀时，体积视具体实验而定。
7、使用病毒侵染细胞时，细胞密度对侵染效率影响较大，细胞汇合密度过高会降低侵染效率。

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