BioVector® pEGFP-C1-PKAgamma Cys1 荧光表达质粒 / BioVector® pEGFP-C1-PKAgamma Cys1 Fluorescence Expression Plasmid

通用定义 / General Definition:

BioVector® pEGFP-C1-PKAgamma Cys1 是一种用于在哺乳动物细胞中表达 EGFP（增强型绿色荧光蛋白） 与 PKAgamma（蛋白激酶 A 催化亚基 $\gamma$ 亚型） 融合蛋白的表达载体。在该特定构建体中，Cys1 通常指代针对 PKAgamma 序列中第 1 位（或特定位点）半胱氨酸的突变或修饰。pEGFP-C1 骨架提供了强力的 CMV 启动子，并在融合蛋白的 N 端 带有 EGFP 标签。该质粒主要用于研究 PKA $\gamma$ 亚型的细胞定位、激酶活性调控、半胱氨酸介导的氧化还原敏感性以及其在生殖组织（PKA $\gamma$ 主要表达于睾丸）中的特定信号转导功能。

BioVector® pEGFP-C1-PKAgamma Cys1 is a mammalian expression vector designed to produce a fusion protein of EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) and the $\gamma$ catalytic subunit of Protein Kinase A (PKAgamma). In this specific construct, Cys1 typically refers to a mutation or specific modification of a cysteine residue (potentially at position 1 or a prioritized site) within the PKAgamma sequence. The pEGFP-C1 backbone utilizes a strong CMV promoter and places the EGFP tag at the N-terminus of the fusion. This plasmid is primarily used to investigate the subcellular localization, kinase activity regulation, redox sensitivity involving cysteines, and the tissue-specific signaling roles of the PKA $\gamma$ isoform, which is predominantly expressed in the testes.

BioVector® pEGFP-C1-PKAgamma Cys1 技术说明书 (Technical Datasheet)

中文版说明书 (Chinese Datasheet)

1. 质粒基本信息

• 启动子： CMV (Cytomegalovirus) 启动子（强力、组成型表达）。

• 融合标签： EGFP (N-terminal fusion)。

• 插入片段： PKAgamma (PRKACG)，携带 Cys1 突变。

• 复制子： pUC ori。

• 细菌抗性： 卡那霉素 (Kanamycin, 50 $\mu$g/mL)。

• 真核筛选： 新霉素/G418 (Neomycin/G418)。

2. 核心生物学功能

• 荧光示踪： EGFP 允许通过荧光显微镜实时观察 PKA $\gamma$ 在活细胞内的分布（如细胞核与细胞质的穿梭）。

• 半胱氨酸功能研究： Cys1 突变通常用于探索半胱氨酸对蛋白激酶结构的稳定性影响或其是否参与形成二硫键/氧化还原调节。

• 激酶研究： 研究 $\gamma$ 亚型与经典 $\alpha$ 或 $\beta$ 亚型在底物特异性上的差异。

3. 实验应用方案

• 细胞转染： 适用于 HEK293T、HeLa 或原代精母细胞等哺乳动物细胞系。

• 免疫共沉淀 (Co-IP)： 利用 EGFP 抗体拉取融合蛋白，分析 PKA $\gamma$ 的相互作用组。

• FRET 实验： 与表达 PKA 调节亚型（R 亚型）的红色荧光载体共转，研究全酶的解离与激活。

4. 注意事项

• 突变核对： 建议通过 Sanger 测序确认 Cys1 突变的准确性及读码框是否对齐。

• 表达强度： 由于 CMV 启动子极强，过度表达可能导致融合蛋白在胞浆内形成非特异性聚集，实验时可尝试调整转染质粒量。

English Datasheet

1. Basic Plasmid Information

• Promoter: CMV (Cytomegalovirus) – high-level constitutive expression in most mammalian cells.

• Fusion Tag: EGFP (N-terminal).

• Insert: PKAgamma (PRKACG) with Cys1 mutation/modification.

• Replicon: pUC ori.

• Bacterial Selection: Kanamycin (50 $\mu$g/mL).

• Eukaryotic Selection: Neomycin/G418.

2. Key Biological Functions

• Fluorescent Tracking: The EGFP tag enables real-time visualization of PKA $\gamma$ dynamics and subcellular partitioning (e.g., nucleocytoplasmic shuttling).

• Cysteine Mechanism Studies: The Cys1 variant is utilized to determine the role of specific cysteine residues in kinase folding, structural integrity, or sensitivity to oxidative stress.

• Isoform Specificity: Studying the unique enzymatic properties of the $\gamma$ subunit compared to the ubiquitously expressed $\alpha$ and $\beta$ isoforms.

3. Experimental Applications

• Mammalian Transfection: Highly efficient in common cell lines like HEK293, COS-7, or specialized testicular cell models.

• Protein Interaction Profiling: Using anti-GFP beads for pull-down assays to identify isoform-specific binding partners.

• Live-Cell Imaging: Monitoring kinase redistribution following cAMP stimulation or environmental changes.

4. Key Usage Notes

• Sequence Verification: BioVector® recommends verifying the insert via sequencing using the EGFP-N sequencing primer to ensure the Cys1 mutation and frame are correct.

• Photostability: While EGFP is stable, prolonged imaging at high laser power may cause photobleaching; use anti-fade mounting media for fixed samples or optimized exposure for live imaging.

注意 / Note: 质粒应储存在 -20 摄氏度下。反复冻融可能导致 DNA 降解，建议将高浓度原始质粒稀释至 100 ng/$\mu$L 后分装备用。

Store the plasmid at -20°C. Repeated freeze-thaw cycles can lead to DNA degradation; BioVector® suggests aliquoting the stock solution into working concentrations (e.g., 100 ng/$\mu$L) to ensure long-term stability.

BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心

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