BioVector® pDONR222 入门克隆载体 / BioVector® pDONR222 Gateway® Donor Vector

通用定义 / General Definition:BioVector® pDONR222 是基于 Gateway® 重组克隆技术 的核心入门载体（Donor Vector）。它主要用于通过 BP 反应 接收含有 attB 位点的 PCR 产物或 DNA 片段，从而构建入门克隆（Entry Clone）。pDONR222 是 pDONR221 的优化版本，其主要区别在于骨架序列的调整，旨在提高测序引物的通用性和某些宿主菌中的克隆稳定性。它是将目的基因转移至各类表达载体（Destination Vectors）的中转站。

BioVector® pDONR222 is a primary donor vector for the Gateway® Recombination Cloning Technology. It is designed to capture DNA fragments or PCR products flanked by attB sites via a BP reaction, resulting in an Entry Clone. pDONR222 is a functional variant of pDONR221, featuring minor backbone sequence optimizations to enhance sequencing primer compatibility and cloning stability in specific hosts. It serves as the essential intermediate for shuttling genes of interest into various Destination Vectors.

BioVector® pDONR222 技术参数 (Technical Specifications)

1. 载体核心元件

• 重组位点：attP1 和 attP2。它们与含有 attB1/B2 的片段反应，生成 attL1/L2 入门克隆。

• 负筛选标记：ccdB 基因。位于两个 attP 位点之间。只有成功发生重组（替换掉 ccdB）的克隆才能在常规大肠杆菌（如 DH5α）中存活。

• 抗性标记：Kanamycin (卡那霉素 / KanR)。

• 复制子： pUC origin (高拷贝)。

• 测序引物： 兼容 M13 Forward 和 M13 Reverse 引物，方便对插入片段进行双向测序验证。

2. Gateway 反应原理

• BP 反应：$attB(insert)+attP(pDONR222)\to attL(EntryClone)+attR(Byproduct)$。

• LR 反应：$attL(EntryClone)+attR(DestinationVector)\to attB(ExpressionClone)+attP(Byproduct)$。

主要科研应用 (Research Applications)

1. 高通量克隆构建

• 基因库建立： 将大量 ORF（开放阅读框）批量导入 pDONR222，构建标准化的入门克隆库。

2. 跨平台基因表达

• 一转多： 一旦基因进入 pDONR222，无需再次通过限制性内切酶克隆，即可通过简单的 LR 反应将其转移至原核、真核、病毒或植物表达载体中。

3. 序列验证

• 标准中转站： pDONR222 的骨架设计非常适合对 PCR 产物进行初期捕获和 Sanger 测序确认。

实验操作注意事项 (Experimental Guidelines)

• 宿主菌选择：

  • 构建入门克隆： 必须使用常规菌株（如 DH5α, TOP10），此时 ccdB 基因被移除，只有重组成功的克隆生长。

  • 扩增空载体： 必须使用 ccdB 生存菌株（如 DB3.1 或 ccdB Survival 2 T1R），否则质粒无法复制。

• PCR 产物要求： 引物末端需带有标准的 attB1 ($5^{\prime }-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT...$) 和 attB2 ($5^{\prime }-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT...$) 序列。

• 质粒纯度： BP 反应对 DNA 纯度敏感，建议 PCR 产物进行胶回收以去除引物二聚体和杂带。

技术指标 (Technical Data Summary)

注意 / Note: pDONR222 和 pDONR221 在大多数实验中可以互换，但 pDONR222 的序列在 attP 区域附近进行了微调，通常认为它在大型片段克隆中的稳定性略好。pDONR222 and pDONR221 are largely interchangeable; however, pDONR222 features minor sequence adjustments around the attP regions, often providing slightly better stability for larger inserts.

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