BioVector® Human Fabry Disease Skin Fibroblast Cell Line / GM00107 人类法布雷病皮肤成纤维细胞株

一 产品基本信息与细胞生物学背景

• 细胞名称：GM00107（常用别名包括：GM-107、GM0107、WG0464）。

• 物种来源：人类（Homo sapiens），供体为一名10岁的男性患儿。

• 组织源起：源自供体手臂的皮肤组织（Arm, skin），经原代分离获得的有限传代（有限寿命）皮肤成纤维细胞（Skin Fibroblast）。

• 疾病模型与基因突变谱系：

  GM00107 是全球生物医学界用于研究法布雷病（Fabry disease）最经典的突变型人源细胞模型之一。法布雷病是一种罕见的 X 染色体伴性隐性遗传的溶酶体贮积症（Lysosomal Storage Disease, LSD）。该细胞由于 X 染色体上的 GLA 基因（编码 $\alpha$-半乳糖苷酶 A, $\alpha$-Gal A）发生了经典的无义突变（Nonsense Mutation）：

  $$\text{p.Trp162Ter (c.485G>A)}$$

  由于该单核苷酸突变（G$\rightarrow$A）导致 162 位的色氨酸（Trp）提前变异为终止密码子（Ter），使得 $\alpha$-Gal A 蛋白在翻译过程中提前终止，形成无功能的截短蛋白或引发 mRNA 发生降解。

• 核心表型与生化特征（质控数据）：

  • 基因合子状态：由于供体为男性，在 X 染色体上表现为半合子（Hemizygous）突变。

  • 酶活性严重缺失：生化定量分析表明，该细胞内的 $\alpha$-Gal A 酶活性仅为正常健康人的 10% - 27% 左右。

  • 溶酶体病理蓄积：由于该酶的高度匮乏，细胞无法降解糖脂代谢底物，导致大量的三己糖酰神经酰胺（Globotriaosylceramide, Gb3 / GL-3）以及溶血 Gb3（Lyso-Gb3）在细胞溶酶体内发生进行性恶性蓄积，是典型的溶酶体“胀大”与形态学异常细胞模式。

• 细胞增殖类型：有限细胞系（Finite cell line）。注：该细胞未经过端粒酶（hTERT）或病毒癌基因（如 SV40 T 突变）的永生化改造，保留了人类原代成纤维细胞天然的复制衰老（Seneescence）机制，通常可传代次数有限（常规约 10 - 20 代左右），实验中应极为珍惜并严格控制代数。

二 核心科研价值与转化医学应用

GM00107 细胞株在罕见病发病机制以及创新药物筛选中具有不可替代的标杆地位：

1. 新型酶替代疗法（ERT）与分子伴侣制剂（Chaperone therapy）的药效评估：

   用于检测外源性重组人 $\alpha$-Gal A 酶或小分子化学伴侣（如 Migalastat）能否成功穿透该细胞膜进入溶酶体，并重新激活或替代靶向水解受损的 Gb3 蓄积物。

2. 新型底物抑制疗法（SRT）的高通量小分子筛选：

   临床前研究（如利用葡萄糖酰神经酰胺合酶抑制剂 Lucerastat）常以该细胞为模型，通过抑制上游糖脂底物 Gb3 的合成，从而逆转或降低 GM00107 胞内的底物过载和溶酶体强染色状态。

3. 法布雷病足细胞/内皮细胞病变的泛组织替代研究：

   在无法直接获取法布雷病患者极难获取的肾脏足细胞或心肌细胞时，该皮肤成纤维细胞是解构 GLA 突变引发的细胞自噬异常、内质网应激（ER stress）、以及炎症因子释放等全身性病理毒性的通用体外底盘。

三 实验室细胞复苏、温和传代、避免衰老与长期保存标准步骤

1. 专用完全培养基与环境参数

• 基础培养基：高级高糖 DMEM（含 L-谷氨酰胺）或 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)。

• 完全培养基配方：

  • 高糖 DMEM / EMEM 基础培养基

  • 加 15% 优质胎牛血清（FBS）（注：由于是未永生化的有限细胞系，对生长因子的依赖度极高，推荐将常规 10% 的血清比例提升至 15%，以延缓其体外自发衰老进程）。

  • 加 1% 青霉素-链霉素双抗。

  • 可选添加：1% 非必需氨基酸（NEAA）。

• 培养物理参数：标准 37 摄氏度，恒温高湿度饱和，含 5% 二氧化碳（$CO_2$） 的无菌常规孵箱。

2. 冷冻有限细胞的复苏与柔和接种

1. 提前在无菌安全柜中向 T25 培养瓶内注入 5 mL 预热至 37 ℃ 的完全培养基。

2. 从液氮罐中取出 GM00107 冻存管，立刻全量投入 37 ℃ 恒温水浴箱中，快速用力晃动，在 1 分钟左右使管内冰块完全融化。

3. 喷洒 75% 酒精消毒外壁后移入安全柜。

4. 将融化的细胞悬液缓慢滴加至含有 4 mL 预热完全培养基的 15 mL 离心管中，轻柔颠倒一次。

5. 以 800 - 1000 rpm（约 150 g）低速温和离心 5 分钟。（有限原代细胞结构较脆弱，严禁高转速离心以免机械力扯碎细胞膜）。

6. 抽干含有 DMSO 的上清液，加入 1 mL 完全培养基，用移液枪极其轻柔地吸打 2 - 3 次重悬。

7. 接种至 T25 瓶中，十字摇匀，拧松瓶盖，置于 37 ℃ 孵箱中静置暗培养。24 小时后观察贴壁汇合度。

3. 日常贴壁常规传代与防止自发衰老控制（核心控代工艺）

• 传代时机：成纤维细胞呈典型的长梭形、鱼群样排列生长。当细胞汇合度（Confluency）达到 80% - 85% 时必须传代。绝对避免让细胞长至 100% 满瓶或过夜重叠。如果有限细胞系在满瓶状态下挤压过久，会迅速触发“接触抑制”并直接锁定走向无法逆转的自发性细胞衰老（Cellular Senescence）状态，表现为胞体异常扁平变大、内部颗粒增多、失去分裂活性。

• 操作传代流线：

  1. 吸除旧培养基，用无菌 PBS 缓冲液轻轻漂洗细胞表面 1 次以洗净血清。

  2. 加入适量 0.25% Trypsin - 0.02% EDTA 消化液（T25 瓶常规加入 1 mL），置于 37 ℃ 孵箱中消化。

  3. 倒置显微镜下严格动态观察：由于未永生化，该细胞对胰酶极其敏感。通常消化 1 - 2 分钟 即可。一旦在镜下观察到成梭形的细胞两端回缩、胞体变圆、且轻敲瓶身有大量细胞脱落滑行时，必须立刻倒入 2 倍体积的含血清完全培养基终止消化。过消化会严重阻碍其下一次的贴壁效率。

  4. 极其轻柔地吹打瓶壁 3 次，收集悬液，1000 rpm 离心 5 分钟。

  5. 弃上清，用新鲜完全培养基重悬，按照 1:2 至 1:3 的保守比例传代（严禁进行 1:5 以上的高倍数稀释传代，成纤维细胞具有一定的群体依赖性，密度过低会导致细胞不分泌足量的生长因子而停止分裂）。

4. 疾病模型稳定性与质控红线

1. 细胞衰老特征监控：在传代过程中，若发现细胞绝大多数个体由“细长梭形”转变为“巨大、扁平、多边形展平”，且传代后 3 - 4 天仍无法实现翻倍分裂，说明该批次细胞已进入复制性衰老阶段。此时其内部的溶酶体病理特征和底物代谢活性已发生严重偏移，必须果断淘汰该代数细胞，重新复苏低代数的冻存种子株。

2. 纯度控制：作为人类有限皮肤成纤维细胞，每 10 代左右建议抽检是否存在支原体污染，确保实验数据的纯净度。

5. 细胞长期保存标准

• 冻存液配方：推荐使用最高保护级别的营养配方：40% 基础 DMEM/EMEM + 50% 优质纯胎牛血清（FBS）+ 10% 分析级二甲基亚砜（DMSO）。极高比例的血清有助于在冷冻应激中保护未永生化细胞的细胞膜结构。

• 冷冻梯度降温规范：

  1. 收集处于对数生长最旺盛期（汇合度约 75% - 80%）、未老化的低代数 GM00107 细胞，离心弃上清。

  2. 用配制好的冷冻液悬浮，调整细胞终密度至 每毫升 1,000,000 个活细胞左右。

  3. 分装入无菌冻存管，立刻放入标准程序降温盒（Mr. Frosty）。

  4. 将降温盒投入 -80 ℃ 超低温冰箱中过夜梯度降温（确保达到 $-1\text{ }^\circ\text{C/min}$ 的标称降温速率）。

  5. 在 24 小时内，必须迅速将冻存管转移入液氮罐（-196 ℃）中实施物理锁死和长期封存。禁止在 -80 ℃ 冰箱中存放超过数周，否则会导致复苏时的存活率出现断崖式下跌。

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