BioVector® pKLAC2 表达质粒载体（乳酸克鲁维酵母表达质粒） / BioVector® pKLAC2 Expression Vector (Kluyveromyces lactis Expression Vector)

一、 背景与来源说明 / Background & Origin

BioVector® pKLAC2 是一种专用于乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）高效表达和分泌重组蛋白的整合型酵母表达载体（Yeast Integration Vector）。

乳酸克鲁维酵母是一种食品级安全（GRAS认证）且生长迅速的酵母宿主，在工业规模发酵中表现优异。BioVector® pKLAC2 载体包含强效的乳糖酶启动子（$P_{LAC4}$）以及来自α-免疫因子（$\alpha$-MF）信号肽序列，能够驱动目的蛋白的高水平合成并将重组蛋白高效分泌至细胞外培养基中。载体中还集成了乙酰胺酶选择标记（amdS），允许在缺乏氨基酸/核苷酸限制的富集培养基（以乙酰胺 Acetamide 为唯一氮源）中直接筛选高拷贝整合重组株，无需使用传统抗生素或营养缺陷型宿主。

二、 质粒载体生物学特征 / Vector Characteristics

• 载体类型 / Vector Type：酵母表达/分泌/整合型载体（Yeast Expression & Secretion Integration Vector）

• 表达宿主 / Expression Host：乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis，如 GG799 菌株）

• 克隆宿主 / Cloning Host：大肠杆菌（E. coli，如 BioVector® DH5$\alpha$ 或 BioVector® TOP10）

• 启动子 / Promoter：强诱导型 $P_{LAC4}$ 启动子（受半乳糖/乳糖诱导，在葡萄糖存在下受抑制）

• 分泌信号肽 / Secretion Signal：$\alpha$-MF 信号肽（$\alpha$-Mating Factor Signal Peptide），介导重组蛋白高效率分泌

• 筛选标记 / Selection Markers：

  • 酵母筛选标记：amdS 基因（表达乙酰胺酶，使酵母可在以 Acetamide 为唯一氮源的 YCB 培养基上生长）

  • 原核筛选抗性：Ampicillin（氨苄青霉素，100 $\mu\text{g/mL}$）

• 主要应用 / Key Applications：工业级与科研级真核重组蛋白（如酶制剂、抗体片段、细胞因子、疫苗抗原）的高效分泌表达

三、 培养条件与操作指南 / Handling & Protocols

1. 大肠杆菌克隆与扩增 / E. coli Cloning & Propagation

• 培养基 / Medium：BioVector® LB Broth 或 BioVector® LB Agar

• 抗性浓度 / Antibiotics：100 $\mu\text{g/mL}$ Ampicillin

• 培养条件 / Incubation：37 摄氏度，振荡培养（220–250 rpm）

2. 酵母转化与发酵表达 / Yeast Transformation & Expression

1. 载体线性化（必需）：使用 restriction enzyme（如 BstX I 或 Sac I）在 $P_{LAC4}$ 启动子区切开 BioVector® pKLAC2，形成线性化表达框，以指导质粒高效同源重组整合至 K. lactis 基因组的 $LAC4$ 位点。

2. 酵母转化：制备 K. lactis 感受态细胞（通常采用 PEG/LiAc 试剂包或电穿孔法），转入线性化 DNA。

3. 筛选与诱导：

   • 涂布于含有 Acetamide 的 BioVector® YCB（Yeast Carbon Base） 筛选平板上培养 3–4 天，挑选耐受乙酰胺的转接阳性单克隆。

   • 使用含有 2% 半乳糖（Galactose）或乳糖（Lactose）的培养基进行诱导，连续取上清检测目标蛋白的分泌表达量。

四、 技术指标简表 / Technical Data Summary

BioVector® pKLAC2 Expression Vector (Kluyveromyces lactis Expression Vector)

1. Background and Origin

BioVector® pKLAC2 is an integrative yeast expression vector optimized for high-level expression and extracellular secretion of recombinant proteins in Kluyveromyces lactis.

K. lactis is a food-grade (GRAS-certified) yeast host that grows rapidly to high cell densities. The BioVector® pKLAC2 vector incorporates a strong, inducible lactase promoter ($P_{LAC4}$) paired with a secretion leader sequence derived from the $\alpha$-mating factor ($\alpha$-MF) signal peptide. For selection, it employs the acetamidase gene (amdS), enabling direct selection of high-copy transformants on rich yeast media containing acetamide as the sole nitrogen source—eliminating the need for antibiotic selection or auxotrophic mutant hosts.

2. Vector Characteristics

• Vector Type: Yeast Expression, Secretion, & Integration Vector

• Expression Host: Kluyveromyces lactis (e.g., GG799 strain)

• Cloning Host: E. coli (e.g., BioVector® DH5$\alpha$ or BioVector® TOP10)

• Promoter: Strong inducible $P_{LAC4}$ promoter (induced by galactose/lactose, repressed by glucose)

• Secretion Signal: $\alpha$-MF Signal Peptide for directing proteins into the culture supernatant

• Selection Markers:

  • Yeast Selection Marker: amdS gene (acetamidase enzyme; enables growth on Yeast Carbon Base with acetamide)

  • Bacterial Selection Marker: Ampicillin (100 $\mu\text{g/mL}$)

• Primary Applications: Secretory expression of industrial enzymes, cytokines, antibody fragments, and biopharmaceuticals in K. lactis

3. Handling Protocols

E. coli Propagation

• Growth Medium: BioVector® LB Broth / BioVector® LB Agar

• Antibiotics: Ampicillin (100 $\mu\text{g/mL}$)

• Incubation: 37 degrees Celsius, shaking at 220–250 rpm

Yeast Transformation & Expression Protocol

1. Linearization: Digest BioVector® pKLAC2 within the $P_{LAC4}$ promoter region using a restriction enzyme (e.g., BstX I or Sac I) to target integration into the chromosomal $LAC4$ locus of K. lactis.

2. Transformation: Transform competent K. lactis cells using chemical (PEG/LiAc) or electroporation methods.

3. Selection & Expression: Plate transformants onto BioVector® YCB Media supplemented with acetamide. Screen positive transformants and induce protein secretion using media containing 2% galactose or lactose.

4. Technical Data Summary

BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心

电话:400-800-2947

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