BioVector® pEX18Tc 质粒载体（广宿主自杀式基因替换载体） / BioVector® pEX18Tc Vector (Broad-Host-Range Allelic Exchange Suicide Vector)

一、 背景与来源说明 / Background & Origin

BioVector® pEX18Tc 是一种广泛应用于革兰氏阴性菌（特别是假单胞菌属 Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas putida 及不动杆菌属 Acinetobacter baumannii）中进行基因敲除、基因替换、点突变或无痕表达框整合的自杀式（Gene Replacement / Suicide）质粒载体。该载体由 Schweizer 课题组（Hoang et al., 1998）开发。

pEX18Tc 结合了 oriT 接合转移起点、四环素抗性标记（$Tc^R$） 以及 $sacB$ 蔗糖致死负筛选标记，并利用 M13/pUC18 质粒的多克隆位点（MCS） 支持蓝白斑筛选。该载体主要依赖于二次同源重组（Two-step Allelic Exchange） 策略，实现无抗性标记、无痕的基因组精准编辑。

二、 质粒载体生物学特征 / Vector Characteristics

• 载体类型 / Vector Type：自杀式/同源重组基因替换质粒（Gene Replacement / Allelic Exchange Suicide Vector）

• 质粒大小 / Vector Size：~6,369 bp

• 克隆与维持宿主 / Cloning Host：大肠杆菌（E. coli，如 BioVector® DH5$\alpha$、BioVector® Stbl3 或 BioVector® S17-1）

• 接合供体宿主 / Conjugation Host：BioVector® S17-1 或 BioVector® SM10（利用 oriT 通过接合转移导入目的菌株）

• 关键调控元件与功能 / Functional Elements：

  • $sacB$ 基因（负筛选标记 / Counter-selection Marker）：表达枯草芽孢杆菌蔗糖果聚糖酶（Levansucrase），在含 5%–10% 蔗糖的培养基上累积毒性高分子果聚糖，导致含有质粒骨架的细胞死亡，用于二次重组（脱离质粒）筛选。

  • $oriT$（IncP 转移起点）：支持从供体大肠杆菌向目标革兰氏阴性菌的接合转移。

  • pUC/ColE1 ori：大肠杆菌高拷贝复制起点。在假单胞菌（Pseudomonas）等目标非肠道菌中无法自主复制，从而强制发生第一步染色体同源重组整合。

  • MCS（多克隆位点）与 $lacZ\alpha$：位于 M13/pUC18 多克隆位点区，可用于蓝白斑筛选插入片段。

• 筛选标记 / Selection Markers：

  • 正筛选标记：四环素抗性基因（$Tc^R$，Tetracycline resistance）

  • 负筛选标记：$sacB$ 蔗糖敏感标记（5%–10% Sucrose sensitivity）

• 主要应用 / Key Applications：假单胞菌及其他革兰氏阴性菌的无痕基因敲除、点突变引入、染色体基因盒替换。

三、 同源重组与基因敲除操作指南 / Knockout Protocol

1. 质粒构建与接合转移 / Construction & Conjugation

1. 重组质粒构建：将目的基因上游同源臂（Up-arm, ~500–1000 bp）与下游同源臂（Down-arm, ~500–1000 bp）克隆至 pEX18Tc 的 MCS 位点中。

2. 导入目标菌株：将重组质粒转化至接合供体菌（如 BioVector® S17-1），与目标菌（如 Pseudomonas aeruginosa）按 1:1 至 1:3 进行滤膜接合（Conjugation），或直接对目标菌进行电转化。

2. 两步法同源重组筛选（Allelic Exchange Strategy）

[第一步：单交叉重组 Integrant]目标基因组 + 重组质粒 ──(正筛选: Tetracycline)──> 质粒整轮整合至染色体 (Cointegrate)[第二步：双交叉重组 Deletion / WT]单交叉整合株 ──(负筛选: 5-10% Sucrose 无抗性)──> 第二次重组发生，质粒脱落                                        ├── 基因敲除突变株 (Knockout Mutant, ~50%)                                        └── 野生型复原株 (Wild-Type, ~50%)

1. 第一步（单交叉整合筛选 / Single-Crossover Selection）：

   • 将接合/电转后的细胞涂布于含 Tetracycline（如假单胞菌 50–100 $\mu\text{g/mL}$） 的 LB 板上。

   • 筛选长出的单克隆（质粒无法自主复制，仅当质粒通过一条同源臂整合至染色体后，菌株才能获得四环素抗性）。

2. 第二步（双交叉重组与脱离 / Double-Crossover & Counter-Selection）：

   • 挑选第一步的单交叉单克隆，于无抗性 LB 液体培养基中过夜培养（释放选择压力，促进第二次同源重组）。

   • 稀释涂布于 无盐 / 低盐 LB + 10% 蔗糖（w/v）平板 上，于 30 摄氏度避光培养 24–48 小时。

   • PCR 验证：挑选蔗糖耐受克隆，同时验证四环素敏感性（$Tc^S$，证明质粒骨架脱落），并利用基因组 PCR 鉴定是否发生靶基因无痕缺失。

四、 技术指标简表 / Technical Data Summary

BioVector® pEX18Tc Vector (Broad-Host-Range Allelic Exchange Suicide Vector)

1. Background and Origin

BioVector® pEX18Tc is a gene replacement suicide vector widely utilized for gene knockout, gene replacement, site-directed mutagenesis, and markerless chromosomal integrations in Gram-negative bacteria, particularly Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, and Acinetobacter baumannii. Developed by Hoang et al. (1998), it remains a staple tool for bacterial genome engineering.

The plasmid combines an incP origin of transfer (oriT), a tetracycline resistance gene ($Tc^R$), and a $sacB$ counter-selection marker within a pUC18-derived MCS framework.This design enables seamless two-step allelic exchange to yield unmarked, scarless mutant strains.

2. Vector Characteristics

• Vector Type: Gene replacement / Suicide vector

• Vector Size: ~6,369 bp

• Cloning Host: E. coli (e.g., BioVector® DH5$\alpha$, BioVector® Stbl3)

• Conjugation Host: E. coliS17-1 or SM10

• Key Functional Features:

  • $sacB$ Gene (Counter-selection Marker): Encodes Bacillus subtilis levansucrase, converting sucrose to toxic levan polymers in Gram-negative hosts.

  • $oriT$ (Origin of Transfer): Enables conjugative transfer from donor E. coli to recipient non-model bacteria.

  • ColE1/pUC ori: High-copy replication origin functional in E. coli but non-replicative (suicidal) in Pseudomonas species, forcing chromosomal integration.

  • MCS & $lacZ\alpha$: Enables blue-white screening for cloned inserts.

• Selection Markers:

  • Positive Selection: Tetracycline resistance ($Tc^R$)

  • Negative Selection: 5–10% Sucrose sensitivity via $sacB$

• Primary Applications: Markerless gene knockouts, chromosomal point mutations, and knock-ins in Pseudomonas species.

3. Protocol Summary for Allelic Exchange

1. Construct Preparation: Clone upstream (~500–1000 bp) and downstream (~500–1000 bp) homology arms into pEX18Tc MCS.

2. Conjugation / Transformation: Transform into donor cells (E. coli S17-1) and perform filter mating with recipient bacteria (e.g., P. aeruginosa) or transfer by electroporation.

3. First Crossover Selection: Plate on LB agar with Tetracycline to isolate single-crossover integrants (cointegrates).

4. Second Crossover Counter-selection: Cultivate integrants in antibiotic-free LB broth, then plate onto salt-free LB agar containing 10% (w/v) sucrose at 30°C.

5. Genotype Verification: Screen sucrose-resistant, tetracycline-sensitive colonies by PCR to confirm target gene deletion.

4. Technical Data Summary

BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心

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