BioVector® pP43-BsCRISPR 无需诱导型枯草芽孢杆菌 CRISPR 基因编辑质粒 / BioVector® pP43-BsCRISPR Constitutive Bacillus subtilis CRISPR Editing Vector

一、 背景与来源说明 / Background & Origin

BioVector® pP43-BsCRISPR 是一种专门针对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）及其近缘芽孢杆菌高效基因组编辑而设计的无需诱导（Constitutive / Expression-Ready）单质粒 CRISPR/Cas9 系统。

传统芽孢杆菌 CRISPR 编辑载体（如基于 $P_{spac}$ 或 $P_{xyA}$ 启动子的质粒）通常依赖木糖（Xylose）或 IPTG 等外源诱导剂来激活 Cas9 蛋白或 gRNA 的表达，增加了发酵与操作流程的复杂性。BioVector® pP43-BsCRISPR 载体利用枯草芽孢杆菌强效的组成型 P43 启动子（P43 Promoter）驱动 Cas9 蛋白及 sgRNA 的持续稳态表达，实现了“转入即编辑”的简便流程。同时，载体内置温敏复制起点（Temperature-sensitive origin,如 pE194ts）或反向筛选标记，确保在完成靶基因敲除、敲入或点突变后，可以通过提高培养温度（如 42 摄氏度）快速无痕地剔除编辑质粒。

二、 质粒载体生物学特征 / Vector Characteristics

• 载体类型 / Vector Type：枯草芽孢杆菌无痕基因组编辑质粒（B. subtilis CRISPR/Cas9 Genome Editing Vector）

• 表达宿主 / Expression Host：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，如 168、WB800、PY79 等）及其他芽孢杆菌属

• 克隆宿主 / Cloning Host：大肠杆菌（E. coli，如 BioVector® DH5$\alpha$ 或 BioVector® TG1）

• 核心调控元件 / Functional Elements：

  • Cas9 表达启动子：强组成型 P43 启动子（无须添加任何诱导剂，持续稳态高表达）

  • sgRNA 转录启动子：小 RNA 强启动子（如 $P_{veg}$ 或 $P_{grsA}$）驱动 sgRNA 高效表达

  • 质粒固化/剔除机制：温敏型复制起点（Temperature-sensitive ori，30 摄氏度复制维持，42 摄氏度阻止质粒复制以快速丢质粒）

• 筛选标记 / Selection Markers：

  • 芽孢杆菌筛选标记：卡那霉素抗性（Kanamycin, $5\text{--}10\ \mu\text{g/mL}$）或壮观霉素抗性（Spectinomycin）

  • 原核/克隆筛选标记：Ampicillin（氨苄青霉素）或 Kanamycin（卡那霉素）

• 主要应用 / Key Applications：枯草芽孢杆菌基因敲除（Deletion）、基因插入（Knock-in）、点突变（Point Mutation）及多基因连续无痕编辑

三、 基因编辑操作流程 / Genome Editing Protocol

1. sgRNA 与同源重组臂（Donor HR Arms）构建

1. sgRNA 靶点设计：设计针对 B. subtilis 目标基因的 20 bp gRNA 序列（侧翼需含 $5'$-NGG-$3'$ PAM 结构），利用 Restriction Enzyme（如 Bsa I 或 BsmB I）或无缝克隆将其插入 pP43-BsCRISPR 的 sgRNA 骨架中。

2. 同源臂克隆：扩增靶基因上游同源臂（Up-arm, ~500–1000 bp）与下游同源臂（Down-arm, ~500–1000 bp），融合拼接到质粒的 Donor 载体位点。

2. 转化与组成型 CRISPR 剪切编辑

1. 感受态转化：将构建好的重组质粒转化入 B. subtilis 感受态细胞（采用两段法天然转化法或电穿孔法）。

2. 复苏与涂布：复苏后涂布于含 Kanamycin（5 $\mu\text{g/mL}$） 的 LB 板上，于 30 摄氏度 培养过夜（P43 启动子组成型表达 Cas9 切断基因组，同源重组臂修饰切口完成修复）。

3. 基因型鉴定与质粒温敏剔除（Plasmid Curing）

1. PCR 鉴定：挑选单克隆进行菌体 PCR，验证靶基因是否成功敲除或突变。

2. 高温丢质粒：将阳性编辑株接种于无抗性 LB 液体培养基中，于 42 摄氏度 震荡培养过夜，稀释涂布无抗 LB 板；转接验证抗性敏感性（Kan-sensitive），获得无痕编辑终菌株。

四、 技术指标简表 / Technical Data Summary

BioVector® pP43-BsCRISPR Constitutive Bacillus subtilis CRISPR Editing Vector

1. Background and Origin

BioVector® pP43-BsCRISPR is a constitutive, all-in-one CRISPR/Cas9 plasmid engineered for rapid and seamless genome editing in Bacillus subtilis and related Bacillus species without requiring chemical inducers.

Unlike traditional inducible systems that rely on xylose ($P_{xyA}$) or IPTG ($P_{spac}$), BioVector® pP43-BsCRISPR utilizes the strong, constitutive P43 promoter to drive steady-state expression of Cas9 protein and sgRNA. This eliminates induction steps during fermentation. The vector incorporates a temperature-sensitive replication origin (e.g., pE194ts), permitting rapid plasmid curing by shifting culture temperatures to 42°C following targeted knockout, knock-in, or point mutation.

2. Vector Characteristics

• Vector Type: Bacillus subtilis Constitutive CRISPR/Cas9 Genome Editing Vector

• Expression Host: Bacillus subtilis (e.g., 168, WB800, PY79)

• Cloning Host: E. coli (e.g., BioVector® DH5$\alpha$)

• Functional Features:

  • Cas9 Promoter: Strong constitutive P43 promoter (no inducer required)

  • sgRNA Promoter: Small RNA promoter (e.g., $P_{veg}$ or $P_{grsA}$)

  • Plasmid Curing: Temperature-sensitive origin (functional at 30°C, cured at 42°C)

• Selection Markers: Kanamycin (5–10 $\mu\text{g/mL}$) / Ampicillin

• Primary Applications: Seamless gene deletion, integration, and base substitution in B. subtilis.

3. Protocol Summary for Genome Editing

1. Vector Construction: Clone target-specific 20 bp sgRNA spacer into the sgRNA cassette and insert homology repair arms (Up/Down arms, ~500–1000 bp) into the donor site.

2. Transformation & Editing: Transform into competent B. subtilis cells via natural transformation or electroporation. Plate on LB agar with Kanamycin at 30°C. Constitutive P43-driven Cas9 cuts the target locus, resolved by donor homology repair.

3. Genotyping & Curing: Verify successful editing via colony PCR. Culture positive clones in antibiotic-free LB at 42°C to eliminate the temperature-sensitive plasmid, yielding markerless mutants.

4. Technical Data Summary

BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心

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