BioVector® pHEE2E-TRI 植物基因编辑双元质粒载体 / pHEE2E-TRI Plant Genome Editing Binary Vector

一、 背景与来源说明 / Background & Origin

BioVector® pHEE2E-TRI 是一种专为植物基因组编辑（CRISPR/Cas9 系统）设计的植物双元表达质粒载体（Plant Binary CRISPR/Cas9 Vector）。该载体由中国科学院遗传与发育生物学研究所（IGDB）相关团队开发，广泛应用于单子叶植物（如水稻、玉米）及双子叶植物（如拟南芥、烟草）的高效基因敲除与多靶点精准编辑。

BioVector® pHEE2E-TRI 利用 Egg cell-specific promoter（如 EC1.2/EC1.1 卵细胞特异性启动子） 驱动 Cas9 表达，可显著提高在植物生殖细胞及 T1 代遗传接代中的纯合突变效率；其名称中的 TRI 通常代表构建了可同时表达 3 个 sgRNA 靶点的级联表达盒（Triple sgRNA Expression Cassette），实现多基因同时敲除或单基因多位点敲除。

二、 质粒载体生物学特征 / Vector Characteristics

• 载体类型 / Vector Type：植物 CRISPR/Cas9 基因编辑双元载体 / Plant CRISPR/Cas9 Binary Genome Editing Vector

• 宿主与系统 / Hosts & Systems：

  • 转化宿主 / Transformation Host：农杆菌（如 Agrobacterium tumefaciens EHA105、GV3101、LBA4404） / Agrobacterium

  • 克隆宿主 / Cloning Host：大肠杆菌（如 BioVector® DH5alpha、BioVector® TOP10） / E. coli

• 关键功能元件 / Functional Elements：

  • Cas9 驱动启动子 / Cas9 Promoter：EC1.2e-EC1.1p（卵细胞特异性增强型启动子，大幅提升可遗传突变率） / Egg cell-specific EC1.2e-EC1.1p promoter

  • gRNA 表达系统 / gRNA Cassette：植物 U6/U3 启动子驱动，通过 Golden Gate 组装或限制性内切酶表达 3 个 sgRNA（TRI）

  • T-DNA 边界 / T-DNA Borders：LB / RB 边界，用于植物基因组整合

• 筛选标记 / Selection Markers：

  • 大肠杆菌/农杆菌抗性 / Bacterial Resistance：BioVector® Spectinomycin (壮观霉素 50–100 ug/mL) 或 Kanamycin

  • 植物筛选抗性 / Plant Selection Marker：BioVector® Hygromycin B (潮霉素 B 25–50 mg/L)

• 主要应用 / Key Applications：植物多基因同时敲除（Multi-gene knockouts）、单基因大片段缺失、T1 代纯合突变体快速获得 / Plant CRISPR editing, multiplex gene knockout, germline-specific Cas9 expression

三、 植物编辑与转化指南 / Protocol for Plant CRISPR Editing

1. sgRNA 构建与 Golden Gate 组装 / sgRNA Cloning

1. 靶点设计 / Target Design：设计 3 个针对目标基因特异性的 20 bp sgRNA 序列（避免脱靶）。

2. 重叠 PCR / Overlap PCR：利用对应的 U6/U3 启动子引物扩增包含 3 个靶点的表达片段。

3. 金门组装 / Golden Gate Assembly：使用 BsaI / BtgZI 等限制性内切酶与 T4 DNA 酶，将 sgRNA 片段一次性重组克隆入 BioVector® pHEE2E-TRI 载体骨架。

2. 农杆菌转化与植物转化 / Agrobacterium & Plant Transformation

1. 转化农杆菌 / Transformation：将构建好的质粒重组体转入农杆菌（如 EHA105 或 GV3101），在含 BioVector® Spectinomycin 的平板上筛选阳性单克隆。

2. 植物侵染 / Plant Infiltration：

   • 拟南芥：采用农杆菌介导的浸花法（Floral Dip）。

   • 水稻/烟草：采用农杆菌介导的愈伤组织转化或叶片侵染法，并在含 BioVector® Hygromycin B 的培养基上筛选抗性芽。

3. 突变体鉴定 / Mutation Screening

• PCR 与测序 / Sequencing：提取阳性转化子基因组 DNA，扩增靶点周边区域，通过 Hi-TOM 或 Sanger 测序分析纯合/杂合基因敲除突变类型。

四、 技术指标简表 / Technical Data Summary

BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心

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